Ученые Вавиловского университета исследовали генетические и морфологические характеристики двух штаммов Listeria monocytogenes, используемых в производстве ветеринарных вакцин. Родительские штаммы листерий были получены в 1960-х годах во время вспышек листериоза на территории СССР, один в Сибири, другой в Азербайджане. Теперь молекулярно-генетическое исследование показало, что вакцинные штаммы сохранили сходство с родительскими, но существенно различаются между собой.
Некоторые эффективные вакцины были получены до того, как молекулярно-генетические исследования стали широко доступными, и при этом они используются до сих пор. Анализ генетических характеристик штаммов, входящих в состав таких вакцин, - актуальная задача для исследователей. Это в полной мере относится к вакцинам против листериоза.
Грамположительная бактерия Listeria monocytogenes, один из наиболее важных патогенов, инфицирующих пищевые продукты, вызывает септицемию (форма сепсиса), неврологические и репродуктивные заболевания у широкого круга хозяев. Штаммы листерии устойчивы к различным условиям окружающей среды — температуре до 45 °С, широкому диапазону pH, концентрации хлорида натрия до 10%. Заболевание имеет преимущественно спорадический характер (от 0,1 до 10 случаев заболевания на 1 миллион человек), однако смертность во время вспышек может достигать 30%. В группе риска находятся новорожденные, пожилые люди, беременные женщины и лица с ослабленным иммунитетом.
Для идентификации и изучения штаммов L. monocytogenes используют метод мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ), основанный на анализе однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в генах домашнего хозяйства бактерии. По результатам МЛСТ штаммы листерий в настоящее время подразделяются на четыре основные филогенетические линии (I–IV), 526 клональных комплексов (СС) и 1289 сиквенс-типов (ST). Линия I ассоциируется со случаями энцефалита у человека и жвачных животных. Штаммы линии II обычно выделяются из продуктов питания, образцов людей, животных, природных и производственных сред, в то время как представители линий III и IV встречаются редко и выделяются в основном от живых сельскохозяйственных и диких животных. Большинство штаммов линии I и некоторые изоляты линии II представляют собой гипервирулентные клоны, ассоциированные со вспышками листериоза людей и животных (крупного и мелкого рогатого скота). Линия II в основном гиповирулентна.
В начале 1960-х годов в СССР была разработана живая цельноклеточная вакцина АУФ против листериоза, которая успешно использовалась для профилактики листериоза сельскохозяйственных животных. Коммерческие препараты вакцины представляют собой лиофилизат микробных клеток. Вакцина предназначена для введения животным в хозяйствах, неблагополучных по листериозу.
Для изготовления вакцины используются два штамма L. monocytogenes(AUF-1 и AUF-2), аттенуированных с помощью многократного ультрафиолетового облучения или обычных методов с многократными пассажами на бактериологических средах. AUF-1 был получен из дикого полевого штамма A-1, выделенного из клинических образцов овец, больных нейролистериозом, в Омской области в 1965 году. Другой штамм, AUF-2, получен от слабовирулентного штамма A-2, выделенного из пастбищных клещей во время вспышки листериоза среди домашнего скота в 1963 году в Азербайджане. Для того и другого штамма оставались неизвестными филогенетическая линия, клональный комплекс и сиквенс-тип.
Исследователи из Вавиловского университета и ВНИТИ биологической промышленности (Москва) провели МЛСТ вакцинных штаммов AUF-1 и AUF-2 и сравнила их с родительскими штаммами А-1 и А-2. Для этого авторы выполнили амплификацию и секвенирование внутренних фрагментов семи генов домашнего хозяйства (abcZ, bglA, cat, dapE, dat, ldh и lhkA).
По результатам МЛСТ все четыре штамма относились к филогенетической линии II, но к разным клональным комплексам и сиквенс-типам. AUF-1 и A-1 принадлежали к ST1538 и CC7, в то время как AUF-2 и A-2 — к ST124 и CC124. Аллельные характеристики вакцинных и родительских штаммов были идентичными, никаких дополнительных различий в нуклеотидных последовательностях семи генов домашнего хозяйства обнаружено не было.
Филогенетический анализ показал родство между AUF-1, AUF-2, A-1, A-2 и другими штаммами L. monocytogenes со всего мира, принадлежащими к тем же клональным комплексам и сиквенс-типам. Для AUF-1 и AUF-2, а также соответствующих им родительских штаммов был идентифицирован общий предок, обозначенный как CC155, ST155.
Исследователи провели морфологическое сравнение всех четырех штаммов при культивировании на хромогенном селективном агаре для листерий и микроскопическое исследование с окрашиванием по Граму. Штаммы A-2 и AUF-2 образовывали небольшие круглые, полупрозрачные, невыпуклые колонии, а их клетки имели типичную морфологию листерий (короткие палочки). Штаммы A-1 и AUF-1 демонстрировали выраженный полиморфизм со значительным количеством нитевидных клеток и росли несколько медленнее.
Таким образом, штаммы листерий AUF-1 и AUF-2, используемые в производстве живой ветеринарной вакцины против листериоза, относятся к филогенетической линии, штаммы которой часто инфицируют людей, животных, продукты питания, корма и среду обитания сельскохозяйственных животных. При этом они относятся к разным клональным комплексам и сиквенс-типам.
Авторы отмечают, что аттенуация с помощью УФ не повлияла на гены домашнего хозяйства: их нуклеотидные последовательности идентичны в каждой из пар «вакцинный штамм — родительский штамм». Однако выявление морфологические различия бактериальных клеток могут указывать на то, что обработка УФ вызвала мутации в других генах.
На вопросы PCR.news отвечает профессор, доктор медицинских наук Валентина Федорова (ФГБОУ ВО Вавиловский университет).
// Валентина Анатольевна, как обстоит ситуация с вакцинами от листериоза в целом? Все существующие вакцины используют именно те штаммы, о которых говорится в статье, или есть и вакцины другого состава?
В настоящее время только в РФ производятся и активно используются коммерческие вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных, содержащие аттенуированные штаммы АУФ (см. обзорную статью нашей научной группы). Аналогов за рубежом нет. В нашей стране была предложена, но не производится еще одна вакцина.
// Есть ли необходимость в разработке новых вакцин против листериоза? Ведутся ли такие разработки у нас в стране или за рубежом?
Согласно официальной позиции ВОЗ, листериоз пищевого происхождения является одной из самых тяжелых пищевых токсикоинфекций и представляет значительную проблему для мирового общественного здравоохранения в связи с высокими уровнями госпитализации (до 95%) и смертности (до 20–30%). Поскольку вспышки листериоза у людей носят преимущественно спорадический характер, проводят вакцинацию продуктивных животных, предотвращая появление и размножение листерий в продуктах животноводства без достаточной термообработки, таких как мягкие сыры, яйца, молоко, творог.
Однако создание вакцин против данной инфекции достаточно затруднено, поскольку такие вакцины должны преимущественно индуцировать Т-клеточное звено иммунного ответа, что связано с особенностями жизненного цикла листерий. Множество научных групп и ученых по всему миру (в Германии, Болгарии, Венгрии, Сербии, Китае и других странах) проводят эксперименты, связанные с поиском специфической иммунопрофилактики этой инфекции. Используются подходы, связанные с созданием рекомбинантных штаммов листерий, живых аттенуированных моно- и бивалентной и цельноклеточных бивалентных инактивированных вакцин, на основе различных сероваров возбудителя, а также новейшие разработки, включающие иммунизацию плазмидной ДНК, создание модифицированных штаммов листерий с дефицитом ключевых иммуногенных белков, иммунизацию антигенами возбудителя в комплексе с различными адъювантами. Тем не менее ни одна из перечисленных разработок не привела к созданию ветеринарной вакцины против листериоза.
Результаты исследования, поддержанного грантом РНФ, опубликованы в журнале Zoonoses.
Фото: LabMedica.com (https://www.labmedica.com/microbiology/articles/294768345/listeria-may-pose-serious-threat-early-in-pregnancy.html)
Источник: PCR News (Science Media Projects - научно-образовательная экосистема в сферы биологии и медицины).